【專利類型】外觀設計【申請人】上海貝高福廚房用具有限公司【申請人類型】企業(yè)【申請人地址】200050上海市長寧區(qū)愚園路1258號2003-2007室【申請人地區(qū)】中國【申請人城市】上海市【申請人區(qū)縣】長寧區(qū)【申請?zhí)枴緾N2006300444
【摘要】 本發(fā)明涉及一種降解氰化物污染木霉菌轉(zhuǎn)化子 的篩選與固定化制備方法，首先利用限制性內(nèi)切酶介導基因整 合技術構(gòu)建木霉菌突變株，通過對出發(fā)菌株及其轉(zhuǎn)化子間氰化 物降解酶系的活性比較分析，篩選出對氰化物高降解活性的木 霉菌轉(zhuǎn)化子，然后在確定了固相化過程中海藻酸鈉和 CaCl2濃度、菌絲包埋量、固定 化時間、降解溫度與時間等因素的基礎上，使用海藻酸鈉作為 載體包埋轉(zhuǎn)化子細胞，制備固定化細胞小球，即為固定化木霉 菌轉(zhuǎn)化子。利用本發(fā)明制備的木霉菌轉(zhuǎn)化子對含氰廢水進行修 復，其對氰化物的降解速度比游離細胞的降解速度要快，而且 方便回收及再利用。 （macrodatas.cn） （來 自 馬 克 數(shù) 據(jù) 網(wǎng)） 【專利類型】發(fā)明申請 【申請人】上海交通大學 【申請人類型】學校 【申請人地址】200240上海市閔行區(qū)東川路800號 【申請人地區(qū)】中國 【申請人城市】上海市 【申請人區(qū)縣】閔行區(qū) 【申請?zhí)枴緾N200610030903.X 【申請日】2006-09-07 【申請年份】2006 【公開公告號】CN1916157A 【公開公告日】2007-02-21 【公開公告年份】2007 【IPC分類號】C12N1/14; C12N15/80; C12N11/04; C12R1/885; C12N11/00 【發(fā)明人】陳捷; 周曉英; 劉力行; 陳云鵬 【主權項內(nèi)容】1、一種降解氰化物污染木霉菌轉(zhuǎn)化子的篩選與固定化制備方法，其特征在 于包括以下步驟： 1)木霉菌轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建：采用質(zhì)粒30-40μg、10U/μl的限制性內(nèi)切酶HindIII 10μl、STC山梨醇緩沖液200μl，配制成酶-質(zhì)?；旌弦海粚舛葹?06-108/ml 的木霉菌原生質(zhì)體懸浮液100μl與配制成的酶-質(zhì)?；旌弦夯靹蚝螅徛?入濃度為60％2ml聚乙二醇，加入5ml預冷的STC，4℃下2000rpm離心15 分鐘，棄上清，加入3ml液體再生培養(yǎng)基，混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中，加入 15-20ml已溶解好并冷卻到45-55℃的固體再生培養(yǎng)基，20-25℃下放置6小 時后，倒入含300μg/ml潮霉素的水瓊脂10-15ml，平鋪在再生培養(yǎng)基上， 2-3天后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子；將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基 進行二次篩選，對正常生長的轉(zhuǎn)化子進行5-7代PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再一次 將轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，將仍能正常生長的 穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子接種到PDA斜面上，放在4℃冰箱中保存；其中，所述液體再 生培養(yǎng)基的配制為：分別取硫酸銨2.8g，尿素600mg，硫酸鉀4g，無水氯 化鈣600mg，葡萄糖40g，蔗糖100g，MgSO4·10H2O？200mg，F(xiàn)eSO4·7H2O？10mg， ZnSO4.7H2O？1·8mg，MnSO4.H2O？3·2mg，CoCl2·6H2O？4mg加入到800ml水中，調(diào) 節(jié)pH值至5.0；固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基的基礎上加入18-20g瓊脂粉； 2)轉(zhuǎn)化子的硅膠粒保存：將經(jīng)降解酶活性測定后得到的降解氰化物活性高的木 霉菌轉(zhuǎn)化子在28℃條件下置于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，平板培養(yǎng)5-7天，使綠色 孢子布滿整個培養(yǎng)皿，取螺旋口玻璃管，放入硅膠粒到玻璃管體積的1/4-1/2， 經(jīng)干熱滅菌處理后，冷卻，使用前冰浴15-30分鐘；取5％滅菌的脫脂牛奶 0.5-2毫升加入培養(yǎng)皿中，水平搖晃，制成孢子懸液；用無菌移液管或槍吸 取0.5-1毫升的孢子懸液，加到已冷卻的玻璃管中的硅膠粒表面，蓋上蓋后， 迅速搖動，使硅膠粒濕潤并粘上孢子，立即放回冰浴，10-20分鐘后，擰緊 蓋子放入4℃或-20℃冰箱中保存； 3)菌絲的培養(yǎng)：取一粒上述浸潤孢子懸液的硅膠粒，放置于倒有PDA的培養(yǎng) 基上，培養(yǎng)5-7天后產(chǎn)生綠色孢子，挑取長有孢子的菌絲與5-6ml無菌水混 合使混合溶液呈綠色，然后過濾，取3ml濾液放入50-100ml？PDB液體培養(yǎng) 基，在搖床中，28℃、100-140rpm下培養(yǎng)60-70小時；將培養(yǎng)好的菌絲過濾， 并用0.7M的NaCl或無菌水將菌絲中培養(yǎng)基沖洗干凈，得到綠色的濕菌絲 體； 4)固定化小球的制備：按2g-3g海藻酸鈉、1g硅藻土置于100ml蒸餾水的比例， 將海藻酸鈉、硅藻土置于蒸餾水中，加熱攪拌溶解并濕熱滅菌，配制成海藻 酸鈉溶液；配制質(zhì)量濃度為2-3％的CaCl2溶液，裝于瓶中濕熱滅菌，按每 200ml海藻酸鈉溶液中放入濕菌絲5克的比例，將濕菌絲放入滅菌后的海藻 酸鈉溶液中攪拌均勻，使用20-50ml注射器吸取菌絲混合液，用針頭將其打 入200ml-400ml的上述CaCl2溶液中并勻速攪拌，形成φ3-5mm的小球，之 后小球在CaCl2溶液中4℃下固定2-3小時，過濾得到固定化小球；用已滅 菌的質(zhì)量濃度為0.9％的NaCl溶液沖洗后，繼續(xù)將小球放入體積濃度為 0.1-0.3％的戊二醛溶液中進行交聯(lián)30秒-2分鐘，用無菌水沖洗后，得到制 備好的固定化小球，即為固定化木霉菌轉(zhuǎn)化子，4℃保存。 【當前權利人】上海交通大學 【當前專利權人地址】上海市閔行區(qū)東川路800號 【統(tǒng)一社會信用代碼】1210000042500615X0 【被引證次數(shù)】4 【被他引次數(shù)】4.0 【家族被引證次數(shù)】4
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